Giới thiệu
Nghiên cứu này tập trung vào việc biểu hiện và đặc tính hóa các dạng hòa tan của các vùng ngoại bào (ECDs) thuộc các tiểu đơn vị β, γ và ε của thụ thể acetylcholine (AChR) ở cơ người. Các protein tái tổ hợp này đã được sản xuất thành công trong hệ thống biểu hiện nấm men Pichia pastoris, thu được dưới dạng hòa tan, có khả năng glycosyl hóa và đạt được số lượng đủ cho các phân tích tiếp theo. Kết quả thực nghiệm cho thấy các protein được biểu hiện sở hữu các đặc điểm cấu trúc tương đồng với trạng thái tự nhiên của chúng. Điều này khẳng định tiềm năng ứng dụng của chúng như là vật liệu khởi đầu quan trọng cho các nghiên cứu chuyên sâu về cấu trúc phân tử và phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh nhược cơ.
Ngành
Hóa sinh, Miễn dịch học
Tóm tắt nội dung tài liệu
Nghiên cứu trình bày phương pháp biểu hiện và đặc tính hóa các dạng hòa tan của vùng ngoại bào (ECDs) của các tiểu đơn vị β, γ và ε của thụ thể acetylcholine (AChR) ở cơ người. Các protein tái tổ hợp được biểu hiện trong Pichia pastoris, thu hồi dưới dạng hòa tan, glycosyl hóa và với số lượng đủ. Các phân tích cho thấy protein biểu hiện có cấu trúc tương tự trạng thái tự nhiên, phù hợp cho nghiên cứu cấu trúc và chẩn đoán nhược cơ.
Mục lục chi tiết
- Giới thiệu
- Từ khóa
- Tóm tắt
- Các tiểu đơn vị ngoại bào hòa tan của AChR
- Cấu trúc và đặc tính hóa các dạng hòa tan của vùng ngoại bào của các tiểu đơn vị β, γ và ε của thụ thể acetylcholine ở cơ người
- Biểu hiện và tinh sạch các protein
- Phân tích sắc ký lọc gel của các polypeptide
- Phổ CD
- Sự gắn kết của kháng thể đơn dòng (mAbs) với các ECD thông qua ELISA
- Sự gắn kết của huyết thanh kháng-β của thỏ với β1-221 tái tổ hợp và AChR ở người
- Sự gắn kết của kháng thể MG ở người với các ECD tái tổ hợp
- Thảo luận
- Quy trình thực nghiệm
- Nuôi cấy vi khuẩn và nấm men, điều kiện nuôi cấy, plasmid và thao tác DNA
- Nhân dòng bằng PCR
- Chuyển đổi nấm men và sàng lọc các dòng dương tính bằng dot-blot
- Biểu hiện quy mô lớn và tinh sạch protein
- Khử glycosyl hóa trong ống nghiệm
- Phân tích FPLC của các polypeptide
- Gắn nhãn phóng xạ các dấu chuẩn protein và α-bungarotoxin
- Chuẩn bị huyết thanh kháng-(tiểu đơn vị β) của thỏ
- Phổ CD
- ELISA
- Chuẩn bị hạt Sepharose gắn ECD
- Sử dụng ma trận ECD-Sepharose để gắn kháng thể AChR trong huyết thanh MG
- RIA cho huyết thanh MG hoặc huyết thanh kháng-(β1-221) của thỏ
- Lời cảm ơn
- Tài liệu tham khảo